dedi tuti blogspot

ISOLASI DAN PERRHITUNGAN TOTAL MIKROBA

I. TUJUAN PERCOBAAN

Ø Dapat mengisolasi bakteri pembentuk asam laktat pada sampel bahan makanan.

Ø Menghitung total bakteri dengan metode SPC.

II. ALAT DAN BAHAN

A. Alat

Ø Cawan petri

Ø Tabung reaksi

Ø Gelas kimia

Ø Autoklaf

Ø Inkubator

Ø Mikro pipet

Ø Pengaduk

Ø Erlenmeyer

Ø Spatula

Ø Kertas timbang

Ø Kapas

Ø Hot plate

Ø Kasa

Ø Aliminium foil

B. Bahan

Ø Sampel bahan makanan (yogurt)

Ø Pepton water

Ø Glukosa

Ø Pepton

Ø Aquades

Ø Beef ekstrak

Ø Bakto agar

III. DASAR TEORI

Bakteri tersebar sangat luas baik ditanah, air dan udara, bila hendak mengisolasi bakteri dari tanah/ benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut, atau zat cair lain, maka dilakukan serangkaian pengenceran (dilution series) terhadap zat tersebut. Sumber isolat dari bakteri benda yang liat atau padat, misatnya daging maka zat tersebut dihancurkan terlebih dahulu. Terhadap bakteri yang hanya terdapat dipermukaan maka pengenceran dilakukan terhadap air tempat zat tersebut dicelupkan/ direndam. Dan jika bakteri hendak diisolasi dari udara, cukup dengan membuka cawan Petri yang berisi media agar steril beberapa saat.

Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal (Pelczar, 1986).

Isolasi suatu galur murni pada prinsipnya dapat dilakukan secara bertingkat. Tingkat pertama biasa dilakukan secara manual yaitu dengan cara sejauh mungkin mengencerkannya. Seringkali sampai 10^-4atau 10^-6. Beberapa tingkat pengenceran terakhir dipupuk pada media padat dengan harapan akan tumbuh yang lebih terpisah jauh sehingga dapat diambil satu koloni yang dianggap murni untuk sementara. Tingkat kedua adalah dengan media yang bersifat selektif bagi mikroba tertentu atau beberapa mikroba tertentu yang mungkin masih satu golongan. Tingkat ketiga dari koloni yang seolah-olah sudah murni mungkin masih perlu untuk diencerkan kembali atau diisolasi ulang agar tingkat kemurniannya dapat lebih meyakinkan. Untuk selanjutnya diperlukan berbagai metode karakterisasi sebagai pembuktian bahwa galur isolat yang diperoleh benar-benar galur murni. Cara bertingkat tersebut adalah cara konvensional yang sampai kini masih banyak dilakukan.

Kultur murni atau biakan murni sangat berguna didalam mikrobiologi, yaitu untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri cultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu popolasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja (Hadioetomo, 1993). Sifat organisme dalam suatu biakan murni dapat dipelajari dengan metode yang amat keras dengan hasil yang sangat akurat karena pengaruh sel hidup yang lain dapat ditiadakan (Volk, 1993).

Terdapat beberapa cara untuk mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan dan untuk menanam suatu species yaitu :

1. Penanaman dengan penggoresan

Merupakan cara rutin yang dipakai untuk mengasingkan mikroba agar didapatkan biakan murni.

2. Penanaman lapangan

Dilakukan dengan membasahi seluruh permukaan lempeng agar dengan suspensi mikroba.

Cara yang dapat dilakukan untuk mendapatkan biakan murni terdapat beberapa, yaitu:

1) Pengenceran

2) Penuangan

3) Penggesekan

4) Single cell isolatiom

5) Inokulasi hewan (Budiarti, 2009)

Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba yaitu:

1) Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi.

2) Tempat hidup atau asal mikroba tersebut.

3) Medium pertumbuhan yang sesuai.

4) Cara menginokulasi mikroba.

5) Cara menginkubasi mikroba.

6) Cara menguji bahwa mikrobia yang diisolasi telah berupa kultur murni dan sesuai dengan yang dimaksud.

7) Cara memelihara agar mikrobia yang telah diisolasi tetap merupakan kultur murni.

Penggunaan media bukan hanya untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba, tetapi juga untuk tujuan-tujuan lain, misalnya untuk isolasi, seleksi, evaluasi, dan deferensiasi biakan yang didapatkan. Artinya penggunaan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba, banyak dilakukan dan dipergunakan. Sehingga tiap-tiap media mempunyai sifat (spesifikasi) tersendiri sesuai dengan maksudnya (Baker, 1986).

Bakteri adalah salah satu contoh mikroorganisme yang penting dan memiliki bentuk yang beragam. Pada umumnya bakteri berhubungan dengan makanan. Adanya bakteri dalam bahan pangan dapat mengakibatkan pembusukan yang tidak diinginkan atau menimbulkan penyakit yang ditularkan melalui makanan atau dapat melangsungkan fermentasi yang menguntungkan (Buckle, 1987). Bakteri asam laktat (LAB) secara trdisional digunakan sebagai kultur starter pada fermentasi susu, sayuran dan daging. LAB memproduksi zat anti bakteri meliputi produk metabolit seperti asam organik, hidrogen peroksida dan diasetil. Selain itu LAB juga memproduksi zat anti bakteri yang disebut dengan bakteiocin.

Dilakukan serangkaian pengenceran terhadap zat tersebut untuk mengisolasi bakteri dari tanah/benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut atau zat cair. Misalnya suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran diencerkan dalam suatu tabung tersendiri secara berkelanjutan dari suatu tabung ke tabung lain (Dwidjoseputro, 1994). Pertumbuhan bakteri pada medium agar pada umumnya berbentuk koloni berupa lendir dan mengkilap. Pemurnian dengan suhu inkubasi 30ºC selama 2 x 24 jam (Cappuccino & Sherman, 1983).

Selain bakteri, di alam masih terdapat mikroorganisme lain seperti khamir dan fungi. Khamir termasuk fungi, tetapi dapat dibedakan dari kapang karena bentuknya yang uniseluler, dan memiliki ukuran 5 dan 20 mikron (Fardiaz, 1992). Biasanya berukuran 5 sampai 10 kali lebih besar dari bakteri. Sumber khamir terutama terdapat pada daun-daun, bunga-bunga, eksudat dari tanaman, buah lewat masak, tanah kebun buah, serta khamir yang banyak di jual dipasaran.

Khamir/yeast dapat tumbuh dalam media cair dan pada dengan cara yang sama dengan bakteri. Penampakan pada medium akan tampak seperti koloni bakteri, hanya saja koloninya tidak mengkilap (Buckle, 1987).

Fungi/kapang sangat berlawan dengan bakteri dan khamir/yeast, seringkali dapat dilihat oleh mata. Bentuk khas yang dimiliki oleh kapang adalah adanya filamen (miselium) (Fardiaz, 1992). Inilah yang membedakannya dengan mikroorganisme lainnya. Fungi mempunyai bentuk seperti kapas dan biasanya terlihat pada kertas- kertas koran basah, kulit yang sudah usang, dinding basah, buah-buahan yang membusuk dan bahan pangan lain seperti keju dan selai. Sumber fungi hampir sama dengan bakteri, hanya saja perbedaannya populasi fungi di air lebih sedikit dan fungi lebih menyukai pH lingkungan yang rendah (Buckle, 1987). Pemurniannya dengan suhu inkubasi 28ºC selama 2 x 24 jam.

Pengukuran kuantitatif populasi suatu mikroba dapat dilakukan dengan penentuan jumlah sel dan penentuan massa sel (Fardiaz, 1992). Ada berbagai macam cara untuk mengukur jumlah sel antara lain dengan hitungan cawan, hitungan mikroskopis langsung, atau dengan alat colony counter (Hadioetomo, 1993).

Teknik Pengambilan Sampel

Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel.

1) Sampel tanah

Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran.

2) Sampel udara

Jika mikroba yang diinginkan adalah berada di udara sekitar, misalnya di kamar mandi, ruangan dan lain-lain, maka caranya hanya dengan membuka tutup cawan petri yang berisi media steril selama ±5 menit.

3) Sampel air

Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.

Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)

1. Teknik Preparasi Suspensi

Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparasi bergantung kepada bentuk sampel :

a) Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.

b) Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass.

c) Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antara lain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Untuk sampel dari tanah tak perlu dimaserasi.

2. Teknik Pengenceran Bertingkat

Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.

3. Teknik Penanaman

a) Teknik penanaman dari suspensi

Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.

· Spread Plate (agar tabur ulas)

Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :

- Ambil suspensi cairan sebanyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan di atas permukaan agar yang telah memadat.

- Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.

- Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.

- Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.

· Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut :

- Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC)

- Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong

- Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.

Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

b) Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)

Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru.

· Goresan Sinambung

Cara kerja

- Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar.

- Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis.

Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru

· Goresan T

Cara kerja :

- Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker.

- Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag.

- Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna.

- Lakukan hal yang sama pada daerah 3.

· Goresan Kuadran (Streak quadrant)

Cara kerja :

Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

IV. PROSEDUR KERJA

Ø Sampel (yogurt) dituangkan ke dalam gelas kimia.

Ø Dipipet 1 ml sampel tersebut ke dalam tabung reaksi.

Ø Ditambahkan 9 ml larutan pengencer yang telah disiapkan dan diberi label 10^-1.